高效液相色譜(HPLC)基本原理詳解！
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高效液相色譜(HPLC)作為一種重要的分離分析技術(shù)，在化學(xué)、制藥、食品科學(xué)及生命科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。理解其基本原理，是掌握和應(yīng)用該技術(shù)的基石。本文將從色譜法的基礎(chǔ)概念出發(fā)，系統(tǒng)介紹HPLC的核心術(shù)語(yǔ)、經(jīng)典理論及影響分離效率的關(guān)鍵因素。
一、 液相色譜法概述
色譜法的分離原理是基于不同化合物在流動(dòng)相與固定相之間的相互作用差異。當(dāng)混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，各組分由于與固定相發(fā)生吸附、分配、離子交換、排阻或親和等作用的強(qiáng)弱不同，導(dǎo)致其在固定相中滯留的時(shí)間不同，從而按先后順序從色譜柱中流出，實(shí)現(xiàn)分離。
若分離過(guò)程中使用的流動(dòng)相為液體，則稱為液相色譜。高效液相色譜則是在此基礎(chǔ)上，采用高壓泵驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，并使用小粒徑(如3-10μm)的多孔硅膠或化學(xué)鍵合固定相，從而大幅提升分離效率和速度。分離后的組分依次進(jìn)入檢測(cè)器，產(chǎn)生的信號(hào)被記錄后，得到一條信號(hào)隨時(shí)間變化的曲線，即色譜流出曲線，或稱為色譜圖。理想的色譜峰應(yīng)呈對(duì)稱的正態(tài)分布曲線。
為了從理論上解釋色譜峰的形狀、探究影響峰展寬的因素，并指導(dǎo)分離條件的優(yōu)化，科學(xué)家們發(fā)展了塔板理論、速率理論等經(jīng)典理論，為色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
二、 核心概念與術(shù)語(yǔ)
HPLC的許多概念源自氣相色譜法，因此兩者在描述分離過(guò)程時(shí)有許多通用術(shù)語(yǔ)。以下是HPLC中常用的基本概念：
色譜圖：樣品流經(jīng)色譜柱和檢測(cè)器所得到的信號(hào)-時(shí)間曲線。
基線：在無(wú)樣品組分流出時(shí)，檢測(cè)器信號(hào)隨時(shí)間變化的曲線。穩(wěn)定的基線應(yīng)平行于時(shí)間軸。
噪聲：基線的波動(dòng)信號(hào)?？赡苡呻娫床环€(wěn)、檢測(cè)器不穩(wěn)定、流動(dòng)相中有氣泡或色譜柱污染等因素引起。
漂移：基線隨時(shí)間產(chǎn)生的緩慢變化。通常由溫度、流動(dòng)相組成或流量的不穩(wěn)定導(dǎo)致。
色譜峰：組分流經(jīng)檢測(cè)器時(shí)產(chǎn)生的連續(xù)信號(hào)曲線，即色譜圖上的突起部分。正常峰近似于對(duì)稱的高斯曲線。不對(duì)稱峰可分為前延峰和拖尾峰。
標(biāo)準(zhǔn)偏差（σ）：用于衡量組分分子在柱中分散程度的一個(gè)指標(biāo)。σ越小，峰形越瘦，柱效越高;反之，σ越大，峰越寬，柱效越低。正態(tài)分布峰的拐點(diǎn)位于峰高的0.607倍處。
峰高（h）：色譜峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。
峰寬（W）：在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處作切線，兩條切線與基線相交兩點(diǎn)之間的距離。
半峰寬（Wh/2）：峰高一半處的峰寬。
峰面積（A）：色譜峰與峰底所包圍的面積，是常用的定量參數(shù)。
死時(shí)間（t0）：指不被固定相保留的組分(如流動(dòng)相溶劑)通過(guò)色譜柱所需的時(shí)間。
死體積（V0）：從進(jìn)樣口到檢測(cè)器流動(dòng)池之間，未被固定相占據(jù)的空間。這部分體積應(yīng)盡可能小，以減少峰的擴(kuò)展。
保留時(shí)間（tR）：從進(jìn)樣開(kāi)始到某組分柱后濃度達(dá)到最大值(即峰頂)所需的時(shí)間。
保留體積（VR）：從進(jìn)樣開(kāi)始到某組分柱后濃度達(dá)到最大值時(shí)，所流出流動(dòng)相的體積。
調(diào)整保留時(shí)間（t’R）：扣除死時(shí)間后的保留時(shí)間，即t’R?= tR?- t0。它更純粹地反映了組分與固定相之間的相互作用。
理論塔板數(shù)（N）：用于定量評(píng)價(jià)色譜柱分離效率的指標(biāo)，簡(jiǎn)稱柱效。N值越大，說(shuō)明柱效越高。基于調(diào)整保留時(shí)間計(jì)算出的理論塔板數(shù)稱為有效理論塔板數(shù)。
理論塔板高度（H）：相當(dāng)于一個(gè)理論塔板所占的柱長(zhǎng)。H = L / N，L為柱長(zhǎng)。H越小，柱效越高。
分配系數(shù)（K）：在一定溫度下，組分在固定相與流動(dòng)相中達(dá)到分配平衡時(shí)的濃度比。
容量因子（k）：組分在固定相與流動(dòng)相中的質(zhì)量之比。它是衡量組分在柱上保留能力的重要參數(shù)。
選擇性因子（α）：相鄰兩組分的分配系數(shù)或容量因子之比，反映固定相對(duì)這兩種組分分離的熱力學(xué)選擇性差異。α > 1.
分離度（R）：相鄰兩峰保留時(shí)間之差與兩峰平均峰寬的比值。R值越大，分離效果越好。通常認(rèn)為R ≥ 1.5時(shí)，兩峰達(dá)到完全分離。
三、 塔板理論：色譜分離的熱力學(xué)解釋
塔板理論將色譜柱比作一個(gè)分餾塔，用熱力學(xué)的觀點(diǎn)解釋了色譜峰的形狀和位置。
基本假設(shè)：
色譜柱由許多連續(xù)的、微小的“塔板”組成。
在每個(gè)塔板內(nèi)，組分在流動(dòng)相和固定相之間瞬間達(dá)到分配平衡。
流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱是間歇式的，每次進(jìn)入一個(gè)塔板體積。
組分的分配系數(shù)在每個(gè)塔板上是常數(shù)，且與組分濃度無(wú)關(guān)。
主要貢獻(xiàn)：
盡管塔板理論的假設(shè)(如瞬間達(dá)到平衡)與實(shí)際的動(dòng)態(tài)色譜過(guò)程存在差異，但它成功導(dǎo)出了色譜流出曲線方程(正態(tài)分布方程)。該方程揭示了：
峰位置：當(dāng)時(shí)間t等于保留時(shí)間tR時(shí)，組分濃度達(dá)到最大值。
峰高與定量關(guān)系：在相同實(shí)驗(yàn)條件下，峰高(h)與進(jìn)樣量成正比，因此峰高可用于定量分析。同時(shí)，柱效越高(σ越小)，峰越高，檢測(cè)靈敏度也越高。
峰面積與定量關(guān)系：對(duì)流出曲線方程積分可知，峰面積(A)正比于組分的總質(zhì)量(進(jìn)樣量)，使其成為更穩(wěn)定、更常用的定量參數(shù)。對(duì)于正常峰，其面積可按公式A = 1.064 × Wh/2?× h計(jì)算。
四、 速率理論：影響柱效的動(dòng)力學(xué)因素
速率理論由Van Deemter等人提出，它從動(dòng)力學(xué)的角度研究了影響色譜峰展寬(即柱效下降)的各種因素。針對(duì)液相色譜的特點(diǎn)，Giddings等人推導(dǎo)出了適用于HPLC的速率方程(Giddings方程)：
H = A + B/u + C·u
該方程將理論塔板高度(H)與流動(dòng)相線速度(u)聯(lián)系起來(lái)，并指出H由三項(xiàng)構(gòu)成，分別對(duì)應(yīng)三種主要的峰展寬因素：
渦流擴(kuò)散項(xiàng)（A）：
由于色譜柱內(nèi)填充顆粒的粒徑大小、形狀和填充均勻性不同，使得同一種組分的分子在流動(dòng)相中流經(jīng)的路徑長(zhǎng)短不一，導(dǎo)致峰展寬。
影響因素：A = 2λdp，其中dp為填料粒度，λ為填充不規(guī)則因子。
優(yōu)化措施：使用顆粒更小、更均勻（球形）的填料，并力求填充得緊密而均勻，可以顯著減小A項(xiàng)，提高柱效。毛細(xì)管柱由于無(wú)填料，A=0.
分子擴(kuò)散項(xiàng)（B/u）：
又稱縱向擴(kuò)散。樣品組分進(jìn)入色譜柱后，由于柱內(nèi)存在軸向的濃度梯度，組分會(huì)由高濃度區(qū)間低濃度區(qū)擴(kuò)散，導(dǎo)致峰展寬。
影響因素：B/u = 2γDm/u，Dm為組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)，γ為阻礙因子。
HPLC中的特點(diǎn)：由于液體的擴(kuò)散系數(shù)Dm遠(yuǎn)小于氣體，因此只要流動(dòng)相流速不是太低，該項(xiàng)在HPLC中對(duì)峰展寬的影響通常可以忽略。
傳質(zhì)阻抗項(xiàng)（C·u）：
這是HPLC中影響柱效的最關(guān)鍵因素。它是指組分在流動(dòng)相、滯留于固定相孔穴內(nèi)的靜態(tài)流動(dòng)相以及固定相本身之間進(jìn)行質(zhì)量轉(zhuǎn)移時(shí)，由于傳質(zhì)速度有限，不能瞬間達(dá)到平衡，從而引起的峰展寬。它包含三個(gè)部分：
流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗：同一流路中流速不均導(dǎo)致。
靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗：組分進(jìn)入并滯留在固定相微孔內(nèi)的靜態(tài)流動(dòng)相中，晚于主流路中的分子流出，是HPLC中最主要的峰展寬因素。
固定相傳質(zhì)阻抗：在液-液分配色譜中，組分進(jìn)出固定液液膜的過(guò)程。
影響因素：傳質(zhì)阻抗項(xiàng)與固定相粒徑的平方（dp2）成正比，與組分在流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)（Dm）成反比。
優(yōu)化措施：
使用小粒度、大孔徑的固定相，以縮短傳質(zhì)距離，減小傳質(zhì)阻力。
使用低黏度的流動(dòng)相，以加快組分分子的擴(kuò)散速度(Dm大)。
對(duì)于化學(xué)鍵合固定相(單分子層)，固定相傳質(zhì)阻抗項(xiàng)可忽略不計(jì)。
綜合結(jié)論：根據(jù)速率理論，為實(shí)現(xiàn)高效分離，應(yīng)采取以下措施：使用小粒度、均勻的球形固定相;采用低黏度流動(dòng)相;選擇合適的流速(通常在1mm/s左右操作，而非理論最佳線速度，以平衡分析時(shí)間和柱效);并盡可能減少進(jìn)樣時(shí)間和檢測(cè)器死體積。
五、 柱外效應(yīng)
除了色譜柱內(nèi)的動(dòng)力學(xué)因素外，色譜柱外的死體積也會(huì)引起峰的額外展寬，即柱外效應(yīng)。這些死體積包括進(jìn)樣器、連接管路、檢測(cè)器流通池等未被固定相占據(jù)的空間。
影響：柱外效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致峰形變寬、拖尾，尤其是對(duì)于容量因子（k）較小的組分影響更為顯著。柱子本身的柱效越高、內(nèi)徑越小，柱外效應(yīng)的相對(duì)影響就越大。
消除方法：應(yīng)盡量減小柱外死體積，如使用“零死體積”接頭、縮短連接管路、采用小體積檢測(cè)池，并將樣品直接進(jìn)樣到柱床中心。
理解并掌握以上基本原理，是我們?cè)趯?shí)際工作中能夠科學(xué)地選擇色譜柱、優(yōu)化分離條件、準(zhǔn)確解析色譜圖和解決分析問(wèn)題的基礎(chǔ)。希望本文能幫助您對(duì)高效液相色譜有一個(gè)更系統(tǒng)、更深入的認(rèn)識(shí)。
發(fā)布于: 2023-08-28